NiFast指示剂型质粒大量提取试剂盒(柱型)

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产品简介：

本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，加入指示剂，能够判断裂解和中和效果，防止中和不完全造成产量降低，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。得到的DNA 比传统试剂盒纯度更高，可直接用于酶切、转化、测序及PCR 等分子生物学实验。

产品特点：

■ 快 速：节省时间，可重复性好。

■ 简 单：操作简单，步骤少。

储存条件和保质期：室温（15-25℃）放置，可保存18个月。

试剂盒组成：

使用前准备：

1.第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

2.将RNase A全部加入溶液P1中，混匀，每次使用后置于2-8℃保存。

操作步骤：

1. 取100-200毫升过夜培养的菌液，6000xg，离心10min，尽可能的倒干上清，收集菌体。（收集超过50毫升菌液，可以离心弃上清后，在同一个50mL管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体）

   2.用7mL溶液P1(无色)重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。(如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。)

   3.加7mL的溶液P2（蓝色），温和地上下翻转5-10次使菌体充分裂解，室温放置4min。(温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA断裂！所用时间不应超过5min！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠淡蓝色，如果未变清亮淡蓝色，可能由于收集菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体用量。)

   4.加10mL溶液P3（黄色），立即温和地上下翻转5-10次，充分混匀时会出现浅黄色絮状沉淀。4℃ ，至少2500xg离心10min(加大离心力可相应缩短离心时间,如8000xg离心5min)，小心取上清，避免吸取到漂浮的浅黄色沉淀。加入溶液NP3后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。如果上清中还有微小浅黄色沉淀，可再次离心后取上清。)

   5. 将上一步所得上清取15mL加入吸附柱PD7-50中（吸附柱放入收集管中），静置2min，2500xg离心2min，倒掉收集管中的废液。（如果上清体积超过15mL，可以分多次过柱。）

   6. 加入10mL漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!）2500xg离心2min，弃掉废液。

   7. 再次加入10mL漂洗液WB，2500xg离心2min，弃掉废液。

   8. 将吸附柱PD7-50放回空收集管中，2500xg离心2min，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

   9. 取出吸附柱PD7-50，放入一个干净的50mL离心管中，在吸附膜的中间部位加1-2mL洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65℃水浴中预热效果更好），室温放置2min，6000 xg离心2min。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心2min。(洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于1mL，体积过小降低质粒洗脱效率，会减少质粒产量。)

图1： 1mL第一次洗脱，PUC19质粒DNA

图1： 1mL第二次洗脱，PUC19质粒DNA

建议：核酸浓度测定结果表明1ML洗脱体积不是很完全，需要更多质粒应加大洗脱体积。

质粒大量提取试剂盒（柱子吸附法）常规产量参考范围200ug-1mg之间，具体根据质粒性质有所差别，实际情况请自行测试研究。

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